基因組編輯技術通過使用序列特異性核酸酶（sequence-specific nucleases, SSN），在目標基因組序列中產生位點特異性雙鏈斷裂（site-specific double-strand breaks, DSB），然后利用內源性DSB修復機制在目標區域產生各種突變。三種類型的SSN用于在選定位點引入DSB，包括鋅指核酸酶、轉錄激活因子樣效應核酸酶和CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein）（Zhan et al. 2021）。隨后，DSB主要通過兩種途徑修復，非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重組（homology-directed repair，HDR）（Li et al. 2021c）。在NHEJ中，兩個斷裂的末端被簡單地重新連接，在目標位點產生插入和/或缺失。當DSB中存在同源供體序列時，可以使用HDR修復，并可進行基因修飾（Li et al. 2021c）。SSN誘導的DSBs大多數是通過NHEJ進行修復，少數是通過HDR修復。

 

      CRISPR/Cas系統在細菌和古細菌中用來防御外來質粒或病毒DNA元件。根據Cas基因的種類和干擾復合物的性質，它們分為六種類型（Hille et al. 2018）。II型CRISPR/Cas系統具有三個成分，即成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9，負責切割的外來DNA。為了簡化系統，可將雙tracrRNA:crRNA設計為單向導RNA （single guide RNA, sgRNA），以引導Cas9在體外產生DSB。近來，Awan et al.（2022）開發了一種RNA介導的基因組編輯工具CRISPR/Cas9來進行靶向突變。CRISPR/Cas9包含兩個主要成分：負責識別靶DNA的sgRNA和負責在預先設計的靶DNA位點生成DSB的Cas9內切酶。來自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）是第一個被充分研究的RNA引導的核酸內切酶。它是一種多功能蛋白質，包含兩個核酸酶結構域：HNH結構域和RuvC-like結構域（Li et al. 2021b）。這兩個結構域分別切割DNA的一條鏈，產生平末端DSB，DSB觸發DNA修復系統，從而產生靶向突變體。將CRISPR/Cas9應用于靶向突變的唯一條件為靶點處需存在PAM（protospacer-adjacent motif）。對于SpCas9來說，PAM序列為NGG，對于不同的靶位點，只需改變sgRNA中的引導序列即可用于靶位點編輯（Li et al. 2021b）。

      

      2   CRISPR/Cas9基因編輯技術在小麥性狀改良中的應用

 

      迄今為止，CRISPR/Cas9基因編輯技術已經在小麥中廣泛應用，主要應用于提高小麥產量、品質和抗逆性。例如，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）在植物生長發育、病原菌防御和損傷應激等方面具有多種功能。敲除TaLOX2改變了小麥的籽粒大小和重量，提高了小麥的耐貯性（Shan et al. 2014; Zhang et al. 2016）。敲除RING型E3連接酶編碼基因TaGW2增加了小麥籽粒的長度和寬度，從而提高了籽粒產量（Li et al. 2021c）。最近，在冬小麥品種鄭麥7698和春小麥品種Bobwhite中利用CRISPR/Cas9對TaSBEIIa進行靶向誘變，獲得了高直鏈淀粉小麥，為培育營養價值更高的小麥新品種提供了新途徑（Li et al. 2021a）。此外，利用CRISPR/Cas9技術可改良小麥抗病性，例如通過編輯小麥TaMLO基因獲得抗白粉病小麥材料（Wang et al. 2014）。

 

      普通小麥是由A、B和D亞基因組組成的六倍體作物，同時突變位于多個基因組位點的多個基因具有挑戰性。因此，開發一種高效的CRISPR/Cas9介導的多重基因組編輯策略來破譯復雜性狀并促進小麥改良具有重要意義。近來，利用多順反子tRNA策略已成功地在中國優良小麥品種中建立了高效的CRISPR/Cas9多重基因組編輯系統。研究人員以控制穗發芽抗性、氮吸收利用、株型、支鏈淀粉合成和磷轉運的6個基因作為靶基因，分別構建同時靶向2個、3個、4個和5個基因組合的多基因編輯載體，以黃淮麥區大面積種植的小麥品種鄭麥7698為受體材料，實現15個基因組位點同時編輯，獲得了2、3、4、5個基因編輯植株，最高編輯效率可達50%。進一步通過胚拯救和后代分離，成功獲得了無轉基因、多個優異等位基因聚合的小麥新種質（Luo et al. 2021）。小麥高效、通用多基因編輯體系的建立，將有助于促進小麥分子生物學研究和復雜性狀形成的網絡解析，定向創制小麥新種質，加速育種進程。

      

 

      病原菌侵染會顯著降低小麥產量和質量，培育具有廣譜持久抗病品種是控制病害確保小麥生產安全的有效策略之一（Li et al. 2022a）。以CRISPR-Cas9為代表的基因組編輯技術為突變小麥感病基因改良抗病性提供了有力工具（Gao 2021）。感病基因根據其介導的感病機理的不同歸為3類，促進病原菌的寄主識別和侵入的基因，編碼免疫信號負調節因子的基因，滿足病原菌代謝或結構需求并促進其在寄主體內增殖擴展的基因。感病基因的突變或缺失會限制病原菌侵染致病的能力（Garcia-Ruiz et al. 2021）。使用CRISPR-Cas9系統靶向敲除小麥中的感病基因TaWRKY19和TaPsIPK1賦予了小麥對條銹菌的廣譜抗性（Wang et al. 2022b; Wang et al. 2022c）。值得關注的是，Tapsipk1突變體在田間試驗中表現出對條銹菌的廣譜抗性且不影響產量，表明Tapsipk1突變體將成為未來小麥抗性育種的寶貴遺傳資源（Wang et al. 2022c）。利用TALEN系統靶向敲除小麥感病基因TaMLO和TaEDR1增強了小麥對白粉病的抗性（Wang et al. 2014; Zhang et al. 2017b）。有趣的是，由TALEN系統產生的小麥突變體Tamlo-R32賦予了強大的白粉病抗性而且沒有產量損失（Li et al. 2022b）。這些研究表明通過基因編輯突變小麥感病基因可以有效改良小麥抗病性。

 

      傳統的基因組編輯需要植物遺傳轉化和再生，這阻礙了在像小麥一樣遺傳轉化比較困難的植物中的應用（Li et al. 2022a）。最近報道發現小麥WUSCHEL家族再生相關基因TaWOX5的過表達可以克服農桿菌介導的小麥遺傳轉化對基因型的依賴并大大提高小麥轉化效率（Wang et al. 2022a）。過表達小麥生長調節因子GRF4（GROWTH-REGULATING FACTOR 4）與輔因子GIF1（GRF-INTERACTING FACTOR 1）的融合蛋白提高了轉基因小麥的再生效率（Debernardi et al. 2020）。這些新的小麥轉化再生技術顯著提高了通過基因組編輯技術突變小麥感病基因的效率。設計基于大麥條紋花葉病毒的sgRNA遞送載體，并通過病毒感染Cas9轉基因小麥植株，從而實現小麥可遺傳基因組編輯。這種既方便又無需組織培養的基因組編輯方法為突變小麥感病基因進行抗病育種鋪平了道路（Li et al. 2021d）。此外，通過編輯感病基因產生的抗病性狀可以通過雜交引入優良小麥品種，而先進的基因組育種方法如標記輔助選擇和標記輔助回交（marker-assisted backcrossing）可加快這一進程（Li et al. 2022a）。2022年1月24日，農業農村部發布農業用基因編輯植物安全評價指南（試行），自此研究專家可以通過基因編輯技術開發高產、優質、抗病性強的小麥品種。在中國獲得轉基因作物生物安全許可大約需要6年左右，新發布的指南規定獲得基因編輯作物生物安全證書可縮短至2年左右。農業用基因編輯植物安全評價指南（試行）發布將極大推進通過突變小麥感病基因培育小麥抗病品種的進程。盡管過去幾十年在鑒定小麥感病基因方面取得了實質性進展，但要完全揭示小麥感病的分子機制并改造感病基因以獲得小麥的廣譜抗病，我們還有很長的路要走。

      

      參考文獻

      

      Debernardi J M, Tricoli D M, Ercoli M F, Hayta S, Ronald P, Palatnik J F, Dubcovsky J. 2020. A GRF-GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants. Nature Biotechnology, 38(11): 1274-1279

      

      Gao C. 2021. Genome engineering for crop improvement and future agriculture. Cell, 184(6): 1621-1635

      

      Garcia-Ruiz H, Szurek B, Van Den Ackerveken G. 2021. Stop helping pathogens: engineering plant susceptibility genes for durable resistance. Current Opinion in Biotechnology, 70: 187-195

      

      Hille F, Richter H, Wong S P, Bratovic M, Ressel S, Charpentier E. 2018. The biology of CRISPR-Cas: backward and forward. Cell, 172(6): 1239-1259

      

      Li J, Jiao G, Sun Y, Chen J, Zhong Y, Yan L, Jiang D, Ma Y, Xia L. 2021a. Modification of starch composition, structure and properties through editing of TaSBEIIa in both winter and spring wheat varieties by CRISPR/Cas9. Plant Biotechnology Journal, 19(5): 937-951

      

      Li J, Li Y, Ma L. 2021b. Recent advances in CRISPR/Cas9 and applications for wheat functional genomics and breeding. aBIOTECH, 2(4): 375-385

      

      Li M, Yang Z, Chang C. 2022a. Susceptibility is new resistance: wheat susceptibility genes and exploitation in resistance breeding. Agriculture, 12(9): 1419

      

      Li S, Lin D, Zhang Y, Deng M, Chen Y, Lv B, Li B, Lei Y, Wang Y, Zhao L, Liang Y, Liu J, Chen K, Liu Z, Xiao J, Qiu J L, Gao C. 2022b. Genome-edited powdery mildew resistance in wheat without growth penalties. Nature, 602(7897): 455-460

      

      Li S, Zhang C, Li J, Yan L, Wang N, Xia L. 2021c. Present and future prospects for wheat improvement through genome editing and advanced technologies. Plant Communications, 2(4): 100211

      

      Li T, Hu J, Sun Y, Li B, Zhang D, Li W, Liu J, Li D, Gao C, Zhang Y, Wang Y. 2021d. Highly efficient heritable genome editing in wheat using an RNA virus and bypassing tissue culture. Molecular Plant, 14(11): 1787-1798

      

      Shan Q, Wang Y, Li J, Gao C. 2014. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system. Nature Protocols, 9(10): 2395-2410

      

      Wang K, Shi L, Liang X, Zhao P, Wang W, Liu J, Chang Y, Hiei Y, Yanagihara C, Du L, Ishida Y, Ye X. 2022a. The gene TaWOX5 overcomes genotype dependency in wheat genetic transformation. Nature Plants, 8(6): 717-720

      

      Wang N, Fan X, He M, Hu Z, Tang C, Zhang S, Lin D, Gan P, Wang J, Huang X, Gao C, Kang Z, Wang X. 2022b. Transcriptional repression of TaNOX10 by TaWRKY19 compromises ROS generation and enhances wheat susceptibility to stripe rust. Plant Cell, 34(5): 1784-1803

      

      Wang N, Tang C, Fan X, He M, Gan P, Zhang S, Hu Z, Wang X, Yan T, Shu W, Yu L, Zhao J, He J, Li L, Wang J, Huang X, Huang L, Zhou J-M, Kang Z, Wang X. 2022c. Inactivation of a wheat protein kinase gene confers broad-spectrum resistance to rust fungi. Cell, 185(16): 2961-2974.e2919

      

      Wang Y, Cheng X, Shan Q, Zhang Y, Liu J, Gao C, Qiu J-L. 2014. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology, 32(9): 947-951

      

      Zhan X, Lu Y, Zhu J K, Botella J R. 2021. Genome editing for plant research and crop improvement. Journal of Integrative Plant Biology, 63(1): 3-33

      

      Zhang Y, Bai Y, Wu G, Zou S, Chen Y, Gao C, Tang D. 2017b. Simultaneous modification of three homoeologs of TaEDR1 by genome editing enhances powdery mildew resistance in wheat. The Plant Journal, 91(4): 714-724

      

      Zhang Y, Liang Z, Zong Y, Wang Y, Liu J, Chen K, Qiu J L, Gao C. 2016. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA. Nature Communications, 7(1): 1-8

      

      作者簡介：

      

      郭軍，男，博士，教授。目前在西北農林科技大學植物保護學院工作，主要從事小麥條銹病持久控制的基礎與應用基礎研究。

      

      聯系方式：

      

      e-mail: .cn

      

      手機：1375994649。