隨著國內外轉基因產業的不斷發展，種子轉基因檢測已成為種子檢驗的重要項目。我國目前除了棉花以外，尚未批準其他主要農作物的轉基因商業化種植，目前對待轉基因種子是一票否決制，任何非法轉基因種子品種都不能進入審定、生產和銷售環節，因此種子轉基因檢測是種子市場監管的重要技術支撐。目前種子轉基因檢測以PCR技術為基礎，PCR技術的基本原理是以一段特定的核酸分子為模板，通過引物延伸重復性地合成雙鏈DNA。PCR技術在轉基因檢測領域得到了廣泛的應用，在種子轉基因檢測方面發揮了重要作用。

      PCR技術的優越性在于它特異性和靈敏度非常高，能夠檢測到微量的核酸序列。但正是由于它的高效擴增能力，在應用PCR技術進行種子轉基因成分檢測過程中，不可避免地會遇到各種影響結果質量的問題，尤其是檢測污染的問題。種子轉基因檢測實驗室污染會導致假陽性結果，將原本應該是“未檢出轉基因”的種子，誤判為“檢出轉基因”的種子，嚴重影響種子企業對種子的后續處理，給種子企業造成巨大的損失。

      陜西省農作物種子檢驗站近年來多次承擔省部級種子轉基因檢測任務，以及各地市和省內外種子企業委托的種子轉基因檢測樣品檢測任務。2010-2022年累計檢測種子轉基因樣品17010份。工作中，陜西省農作物種子檢驗站科學合理地制定檢測方案，采取各種措施應對種子轉基因檢測實驗室的污染問題，也總結了大量經驗和教訓，為種子轉基因監管提供了強有力的技術支撐。

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      種子轉基因檢測實驗室污染來源分析

       1.1   樣品間污染

      目前除了棉花，我國尚未批準其他主要農作物的轉基因商業化種植，一般種子市場抽查和品種試驗檢測的種子樣品預期結果大多數情況下是“未檢出”，因此轉基因成分檢測目標是“意外混入檢測”（AP檢測）。

      但是，從近幾年的檢測結果看，每年都會出現轉基因檢測為“檢出”的樣品，每年樣品陽性率在1%以下（包括能力驗證中的陽性樣品），如表1所示。同這些陽性樣品同一批次進行檢測的樣品，需要同步進行樣品流轉、粉碎研磨、核酸提取、配置體系、擴增電泳等操作，稍不注意就會產生假陽性結果。可見，樣品間污染是轉基因檢測污染的重要來源。

       1.2   PCR產物污染

      種子轉基因檢測是通過對目標核酸片段進行成百萬倍的復制，來檢測目標核酸片段是否存在于樣品中。如果擴增成功，表明含有該核酸片段；如果未檢測到產物，說明樣品中不含有該核酸片段。

      核酸擴增是進行指數級擴增的，每一次擴增的產物，都是下一次擴增的模板。每一次成功的擴增，都會產生百萬數量級的模板。而以PCR擴增的靈敏度，擴增步驟，也會產生假陽性結果。可見，每個陽性樣1個模板就會檢出。即使有微量的產物進入品或者對照的PCR擴增產物都是重要的污染來源。

       1.3   試劑污染

      PCR檢測過程需要提取、擴增和電泳的各種試劑，涉及種類多，操作過程中氣溶膠或者液體飛濺，都有可能造成試劑污染。使用污染試劑進行樣品檢測，會將“未檢出”誤判為“檢出”的樣品，造成假陽性結果。

      試劑污染的另一個方面，是針對轉基因的某些檢測靶標的，即某些檢測元件總是出現假陽性結果。這是由于PCR擴增的關鍵試劑-耐熱擴增酶是由基因工程菌生產的，這些耐熱擴增酶在生產提純的過程中，會不可避免地帶有某些基因工程菌的核酸片段，比如常見的抗新霉素的新霉素磷酸轉移酶基因（NPTII基因）的核酸片段。NPTII基因也是轉基因植物常用的篩選基因之一。如果耐熱擴增酶在生產中使用了該基因，且提純的過程中沒有完全去除，則必然造成假陽性結果。

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      種子轉基因檢測實驗室污染防控

       2.1   實驗室布局

      合理的實驗室布局能夠有效減少種子轉基因檢測實驗室的污染問題。種子轉基因檢測實驗室總體布局和各工作區域的安排，是以減少其潛在的對樣本的污染、獲得可靠的檢測結果和減輕對人員的危害為目的，可采取必要的物理隔離、增加可控空氣流向的通風設備及相對獨立的區域等有效措施，降低交叉污染、實驗室中其他樣品和擴增材料產生的殘留物污染以及試劑和樣品所引起的假陽性結果等風險。

      一般來說，種子轉基因檢測實驗室布局可按照分子生物學實驗室的要求設計，根據種子轉基因檢測的特點，按照核酸污染程度，可劃分為試劑配制區、樣品制備區、前PCR區和PCR區4個獨立的功能區域（圖1）。每個分隔區獨立使用實驗室設備，開展相應實驗，將能有效消除或降低實驗污染的機會。

      2.1.1 試劑配制區

      用于檢測中所有試劑的存儲、配制和分裝，包括PCR反應體系預混液的配制與分裝。該區域與實驗室的其他區域間必須存在完全的物理隔離，使正常空氣流向不能來自于樣品準備區域、產物分析區域。檢測的樣品不能帶入該區域。如果不能做到正壓，試劑的配制操作必須在該區域專用的生物安全柜或超凈工作臺中進行。

      2.1.2 樣品制備區

      用于樣品的準備、前處理。該區域正常空氣流動不能來自于前PCR區、PCR區。樣品準備區域內部的排氣系統可以排除任何來源于空氣中的污染物，其排出的氣流不能污染到其他幾個區域。任何和樣品接觸的儀器和設備應該進行清洗、消毒。

      2.1.3 前PCR區

      用于核酸提取純化、儲存和在PCR反應體系加入DNA模板。該區域要和樣品制備區、試劑配制區、PCR區分開；該區域的正常空氣流動不能來自于樣品制備區、PCR區；該區域排出的氣流不能流向樣品制備區、試劑配制區；該區域中的正常空氣應該使用正壓，使空氣流向區域外部，以避免來自樣品的交叉污染。如果該區域是完全與PCR區隔離，并且和樣品制備區及試劑配制區沒有空氣交換，那么這個區域的正壓也可以不用設置。

      2.1.4 PCR區域

      用于PCR擴增反應和擴增產物分析。該區必須和其他3個區域進行完全的物理隔離；該區應具備負壓或單向排風條件或設置生物安全柜，使空氣流向區域內部，或者進行內部循環，而不能流向試劑配制區和樣品制備區。

       2.2   減少實驗步驟

      種子轉基因檢測一般分為樣品流轉、粉碎研磨、核酸提取、配置體系、擴增電泳等操作，每一步操作都可能會產生樣品間污染，減少操作步驟能夠有效減少污染。其中實時熒光PCR（TaqMan技術）能夠實時觀測檢測結果，有效減少污染發生。

      一般PCR檢測由核酸提取、PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳3個步驟組成。實時熒光PCR（TaqMan技術）是在一般PCR基礎上，添加1條標記熒光基團和淬滅基團（一般是FAM和TAMRA）的探針，能夠在PCR擴增過程中通過記錄熒光信號強度對擴增產物的積累進行實時監控，從而在擴增結束時對結果進行判斷。以實時熒光PCR技術為基礎的種子轉基因成分檢測可將檢測步驟縮短為兩步，即核酸提取和PCR擴增，提高檢測效率，節約時間成本。實時熒光PCR檢測則采用完全閉管檢測，無需PCR開蓋后處理，避免了交叉污染和假陽性的風險，能夠有效防止PCR產物污染。

       2.3   使用高質量試劑

      使用高質量試劑能夠有效降低試劑污染。首先，應對購買的試劑進行質量測試，避免試劑本身攜帶可檢出的靶標，比如NPTII基因的核酸片段。其次，應對大包裝試劑進行分裝，避免試劑反復凍融，防止反復使用試劑，造成試劑污染。第三，應定期檢測保存的試劑，對變質試劑和過期試劑及時清理，如遇試劑污染，應盡快檢查和處理。

       2.4   設置對照

      設置對照能夠很快發現結果是否準確以及是否存在污染的情況。種子轉基因成分檢測采用的對照包括空白對照、陰性樣品對照和陽性樣品對照。空白對照包括試劑空白對照和提取空白對照。試劑空白對照是在PCR反應體系中用相同體積的水代替模板DNA，用于驗證PCR反應過程中沒有污染。提取空白對照是在DNA提取過程中，用水代替測試樣品完成提取的所有步驟，用以驗證提取過程沒有核酸污染。在同時對多個測試樣品提取DNA并進行PCR分析時，設置提取空白對照是十分必要的。陰性樣品對照是從可溯源的陰性標準物質中提取的不含外源目標核酸序列的DNA，用于驗證測試樣品中是否含有該物種特異性基因（內標基因）以及反應體系是否受到陽性污染。陽性樣品對照是從可溯源的陽性標準物質中提取的DNA或從含有已知序列陽性樣品中提取的DNA，用于驗證測試樣品的檢測過程是否能檢測出陽性片段。陽性對照的轉基因成分含量根據檢測方法的檢出限設置，如檢出限為0.1%的檢測方法，應選用轉基因含量為0.1%的樣品作為陽性對照。利用這些對照的檢測結果，可對檢測過程和檢測結果進行分析和報告（表2）。

       2.5   質量控制計劃

      為確保檢測結果的準確性，種子轉基因成分檢測可采用儀器比對、人員比對、方法比對、樣品復測等方法對檢測結果進行質量控制，防止污染。制定種子轉基因成分檢測結果質量控制計劃，定期采用以上方法對結果進行質量控制，發現污染情況及時處理。如果污染問題常發，可適當增加質量控制的實施次數。

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      種子轉基因檢測實驗室污染應對策略

      實驗室污染會出現假陽性結果，即本應是陰性的樣品擴增出目的條帶。可能的原因是樣品間交叉污染、PCR試劑的污染、PCR擴增產物污染、環境的氣溶膠污染等情況。出現這種情況時，應考慮所用試劑及操作的每一步出現DNA污染的可能性，逐一分析，排除污染。

       3.1   個別樣品污染的原因分析及應對策略

      如果同一批次檢測的樣品只有個別樣品出現污染情況，則很可能是樣品間交叉污染，尤其是該批樣品中有陽性樣品時。這時應將該樣品重新進行單獨檢測，并在檢測中設置提取對照、陰性對照和陽性對照，檢測過程中盡量避免與其他樣品接觸。如果仍有污染，則考慮試劑污染，重新換DNA提取試劑后重復檢驗。

       3.2   大量樣品污染的原因分析及應對策略

      如果同一批次或不同批次檢測的樣品都出現污染情況，且是多檢測元件污染，則考慮是試劑污染或PCR產物污染。試劑污染可能是在操作過程中有產物或者陽性核酸混入了試劑中，這時陰性對照也呈現陽性，需要更換試劑重新實驗。PCR產物污染影響比較嚴重，需要對環境進行清理，整個實驗室可進行核酸酶噴灑、紫外線照射消毒、實驗儀器高溫滅菌等操作。整個實驗室處理完成后需要通風，如有必要，可在通風處進行臨時實驗。

       3.3   某一檢測元件污染的原因分析及應對策略

      種子轉基因檢測中很可能出現某一檢測元件污染，而其他元件正常的情況。這可能是因為核酸擴增酶中自帶檢測目標核酸序列，比如NPTII基因的核酸片段。擴增酶中含有該核酸片段，會導致每個擴增反應包括陰性對照，都會顯示為陽性“檢出”，這就是實驗室遇到的“水中都可以檢出轉基因成分”問題，如圖2所示。這種情況下需要更換使用的擴增體系，對新使用的體系進行測試，以確保新體系中沒有NPTII基因的核酸片段。

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      討論

      種子轉基因檢測實驗室的污染主要來源于樣品間污染、PCR產物污染和試劑污染。防止種子轉基因檢測實驗室污染的方法主要依靠合理的實驗室布局、減少實驗步驟、使用高質量試劑、設置對照和制定合理的質量控制計劃來防控。對于污染的種子轉基因檢測實驗室，應該分析具體原因，對實驗試劑、實驗樣品、實驗環境等進行逐一分析，確定污染源，消除污染因素后繼續實驗。

      一個合格的種子轉基因檢測實驗室，不僅要有先進的檢測技術能力，還應按照轉基因成分檢測的特點，制定合理的防污染措施，以確保檢測結果的準確性和可靠性。隨著我國轉基因政策的不斷放寬，轉基因種子將很快進入審定和種植環節，這對于種子轉基因檢測來說是巨大的挑戰。做好種子轉基因檢測實驗室污染防控將更加重要。（參考文獻略）

      ?本文來自《種子轉基因檢測實驗室污染原因排查和分析應對》

      ?作者：雷軍,茍飛凡,張海波

      ?單位：陜西省種子工作總站；陜西禮泉甘河國家濕地公園管理處

      ?刊于《中國種業》2023年第7期26-30頁 轉載請注明