以下(xia)文章來源于南北學(xue)苑 ，作(zuo)者李召(zhao)輝

      編輯 | 新(xin)銳恒(heng)豐研究院

      來源 |南(nan)北(bei)學院

      作者(zhe) |李召輝

      今天就玉米轉基因品系回交轉育過程中的問題談一點自己的粗淺看法，本人才疏學(xue)淺不(bu)當之處敬請各位(wei)老師專家批評指正！

      2020 年初，農業農村部發布 2019 年農業轉基因生物安全證書(生產應用)批準清單，玉米、大豆位(wei)列其中，轉(zhuan)基(ji)因(yin)玉(yu)米(mi)(mi)的(de)(de)品種(zhong)(zhong)研(yan)發(fa)、產業化進程(cheng)開(kai)啟(qi)。2022 年(nian)(nian) 6 月(yue) 8 日，轉(zhuan)基(ji)因(yin)玉(yu)米(mi)(mi)大(da)豆品種(zhong)(zhong)的(de)(de)國家審定(ding)標準(zhun)印發(fa)，可(ke)謂是一個(ge)(ge)里程(cheng)碑(bei)式(shi)的(de)(de)進展(zhan)。2022 年(nian)(nian)國家組織在甘肅已進行部分轉(zhuan)基(ji)因(yin)玉(yu)米(mi)(mi)品種(zhong)(zhong)的(de)(de)制種(zhong)(zhong)約6.6 萬畝，2023 年(nian)(nian)，農業部監(jian)督實施在內蒙古、吉林、遼寧、河北(bei)、四(si)川和云南六個(ge)(ge)省份的(de)(de)指定(ding)區域(yu)進行大(da)面積(ji)的(de)(de)轉(zhuan)基(ji)因(yin)玉(yu)米(mi)(mi)品種(zhong)(zhong)示(shi)范銷售。

      據悉 2023 年國家組織在甘肅進行部分轉基因玉米品種的制種約 7 萬畝，國家玉米品種區試處今年也調整了轉基因玉米品種試驗參試申報的條件，允許種企自身在性狀公司合法授(shou)權下進行轉基(ji)因品(pin)(pin)種(zhong)參(can)試(shi)申報，2023 年度轉基(ji)因玉米品(pin)(pin)種(zhong)參(can)試(shi)申報數(shu)量(liang) 173 個，其中參(can)加(jia)大(da)區試(shi)驗品(pin)(pin)種(zhong)數(shu)量(liang) 122 個。

      諸(zhu)多(duo)證明，轉基因玉(yu)米(mi)品(pin)(pin)種(zhong)市場化有望在近階段逐漸放開。在此大(da)背景下，我們種(zhong)業(ye)公(gong)司(si)大(da)部分都已經(jing)開展(zhan)了(le)優(you)(you)良品(pin)(pin)種(zhong)的(de)轉育工作(zuo)(zuo)，據悉(xi)好多(duo)大(da)公(gong)司(si)已經(jing)在轉基因玉(yu)米(mi)品(pin)(pin)種(zhong)的(de)轉育、報審進展(zhan)迅速。但對于種(zhong)企優(you)(you)良品(pin)(pin)種(zhong)的(de)回交轉育，應(ying)該注意什么？今天就(jiu)玉(yu)米(mi)品(pin)(pin)種(zhong)轉育工作(zuo)(zuo)的(de)有關(guan)事(shi)項分享(xiang)一(yi)下本人的(de)淺見(jian)之談。

      截止 2023 年 1 月，農業農村部發布《2022 年農業轉基因生物安全證書（生產應用）批準清單（二）》， 其中包括 2 個轉基因玉米項目。至此，我國已陸續頒布 13 張轉基因玉米安全證書。其中，北京大北農生物技術有限公司共擁有 4 個玉米轉基因生物安全證書；北京國豐生科生物科技有限公司，擁有 1個玉米轉基因生物安全證書；杭州瑞豐生物科技有限公司擁有 3 個玉米安全證書；中國種子集團（先正達）擁(yong)有 3 個玉(yu)米(mi)安全(quan)證書；北京糧元生物科技有限公司擁(yong)有 2 個玉(yu)米(mi)轉基因生物安全(quan)證書。詳情如下表(biao)所示：

      當前種企與性狀公(gong)司轉基因育種合作(zuo)方(fang)式主(zhu)要有兩種:

      首先，大部分種企合作(zuo)轉(zhuan)育(yu)的方式是(shi)(shi)種業公(gong)司提(ti)供(gong)受體(ti)親本(ben)材(cai)料(liao)，委托(tuo)性狀公(gong)司做(zuo)轉(zhuan)育(yu)工(gong)作(zuo)；其二是(shi)(shi)性狀公(gong)司提(ti)供(gong)轉(zhuan)化體(ti)的供(gong)體(ti)自(zi)交(jiao)系材(cai)料(liao)，企業自(zi)己對優良自(zi)交(jiao)系材(cai)料(liao)進行(xing)轉(zhuan)育(yu)工(gong)作(zuo)。

      這兩(liang)種方式優(you)缺點：

      1）委(wei)托性狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)公司進行轉(zhuan)(zhuan)育(yu)(yu)(yu)的(de)優點(dian)，其有合法的(de)轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因育(yu)(yu)(yu)種試驗基(ji)地，并且可以(yi)借(jie)助其高通量分子(zi)實驗室，通過(guo)分子(zi)標記多(duo)世代輔助檢測(ce)目標性狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)，轉(zhuan)(zhuan)化選擇(ze)針對性強(qiang)；缺點(dian)是對所(suo)轉(zhuan)(zhuan)育(yu)(yu)(yu)親(qin)本(ben)材料不夠了解，在(zai)(zai)受體(ti)自(zi)交系材料的(de)田(tian)間表型(xing)性狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)上(shang)的(de)鑒定(ding)篩(shai)選有欠(qian)缺，導致轉(zhuan)(zhuan)育(yu)(yu)(yu)親(qin)本(ben)與最初的(de)輪回親(qin)本(ben)在(zai)(zai)田(tian)間表型(xing)性狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)上(shang)有差異，最終(zhong)會影(ying)響組配后(hou)雜交品種的(de)優良農藝性狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)的(de)表達。

      2）企(qi)業自(zi)行(xing)轉育優(you)點(dian)是可以適(shi)當放開穗行(xing)，增加規模，對(dui)輪回親本自(zi)交系材(cai)料了(le)解透(tou)徹，在田間性(xing)(xing)狀選擇上(shang)針對(dui)性(xing)(xing)強；缺點(dian)是大部分種業公司沒有合法的轉基(ji)因試驗(yan)基(ji)地(di)，只能到(dao)國家(jia)指定的轉育基(ji)地(di)進行(xing)種植，操作上(shang)不太方便。

      綜上(shang)來看，要想提高轉(zhuan)(zhuan)育(yu)成功率，則需要性(xing)狀公(gong)司與(yu)育(yu)種家緊密配合(he)，依據(ju)性(xing)狀公(gong)司提供的(de)分子實驗室檢測(ce)(ce)依據(ju)（轉(zhuan)(zhuan)基因事件檢測(ce)(ce)、回交后代的(de)背景恢復率、40SSR 標(biao)記(ji)檢測(ce)(ce)等等），育(yu)種家進行田間表型篩選、配合(he)力測(ce)(ce)定。下(xia)面談一下(xia)本人對回交轉(zhuan)(zhuan)育(yu)工作的(de)淺(qian)薄認識。

      A、利用轉(zhuan)化體進行回交(jiao)轉(zhuan)育(yu)注意事項

      1）（轉化體(ti)）供體(ti)親本(ben)(ben)和輪回(hui)(hui)親本(ben)(ben)進行質控經過檢測(ce)合格的（轉化體(ti)）供體(ti)親本(ben)(ben)、以及輪回(hui)(hui)親本(ben)(ben)，在回(hui)(hui)交轉育(yu)過程中嚴格自交保(bao)純。

      整個(ge)回交轉育選擇中，目標基因(yin)、40SSR 標記檢測、背景恢復(fu)率的(de)計算都是以雙親的(de)標記作為依據的(de)，為了避免因(yin)田間管理(li)或檢測等原(yuan)因(yin)導致的(de)親本(ben)偏差，應該首先對多(duo)份(fen)親本(ben)進(jin)(jin)行質控，檢測親本(ben)的(de)雜(za)合率和(he)缺失率，來選擇最(zui)正確的(de)親本(ben)進(jin)(jin)行后續(xu)轉育及對比分析。

      根(gen)據目(mu)前轉基因品(pin)種(zhong)(zhong)申(shen)報參試要求(qiu)，受體親本(ben)最(zui)好(hao)是母本(ben)系，可以在(zai)將來制種(zhong)(zhong)過程中避免蟲子(zi)危(wei)害(hai)，從(cong)而保證(zheng)種(zhong)(zhong)子(zi)產量與(yu)質量的提升(sheng)

      2）轉(zhuan)育(yu)(yu)一份自(zi)交(jiao)系(xi)(xi)材料(liao)(liao)一般需要 6-7 代(dai)的(de)(de)回交(jiao)和 2-3 代(dai)的(de)(de)自(zi)交(jiao)，共 8-10代(dai)才能完全穩(wen)定純合，需要注意的(de)(de)是導入時要盡(jin)可能做(zuo)到“近緣轉(zhuan)育(yu)(yu)”，即受體(ti)材料(liao)(liao)和供體(ti)材料(liao)(liao)血緣關系(xi)(xi)相近（近緣轉(zhuan)化(hua)供體(ti)），這樣不會因為供體(ti)與受體(ti)因遠緣而造成轉(zhuan)育(yu)(yu)后代(dai)血緣關系(xi)(xi)混亂，轉(zhuan)育(yu)(yu)目標親(qin)(qin)本(ben)自(zi)交(jiao)系(xi)(xi)較(jiao)容易(yi)與原親(qin)(qin)本(ben)保持一致(zhi)性，從而進行轉(zhuan)育(yu)(yu)更容易(yi)、更高效(xiao)。

      應用分子標記進(jin)行輔(fu)助回(hui)交選(xuan)(xuan)擇（Marker-assisted backcrossing, MAB），在每輪后代個體中篩選(xuan)(xuan)出背景恢(hui)復(fu)(fu)率(lv)最高(gao)的(de)材(cai)料用于下(xia)一(yi)輪回(hui)交，可(ke)以大大提高(gao)回(hui)交效率(lv)，甚至可(ke)能僅用 3-4 個回(hui)交世代就可(ke)恢(hui)復(fu)(fu) 98%以上輪回(hui)親本(ben)的(de)基因(yin)組(zu)，還可(ke)以大大降低田間回(hui)交成本(ben)和工作(zuo)量(liang)，再做 2 次自交基本(ben)可(ke)以達到國家(jia)規定(ding)的(de)轉(zhuan)育品種與原品種 DNA 的(de)位點差異小于 2 個的(de)基因(yin)純度要求。

      B、利用轉化(hua)體進行(xing)回交轉育流(liu)程

      1）雜(za)交導入原則：受體(ti)材料和供體(ti)材料選擇近緣轉化體(ti)進行(xing)雜(za)交組配，構建轉育基礎材料。

      2）靶向藥劑篩選：每次(ci)回交(jiao)后經(jing)過(guo)(guo)鑒(jian)定(ding)篩選出(chu)的(de)自(zi)交(jiao)系材料，苗期要用(yong)指(zhi)定(ding)的(de)除草劑進行噴霧處(chu)理，目前國內(nei)已獲批的(de)玉(yu)米(mi)農業應用(yong)型轉化體，抗蟲基(ji)(ji)因(yin)和耐除草劑基(ji)(ji)因(yin)基(ji)(ji)本都是連鎖的(de)，可以(yi)通過(guo)(guo)除草劑進行目標性狀(zhuang)基(ji)(ji)因(yin)田間篩選。

      一般在玉米苗期 3-8 葉期進(jin)行噴施(shi)，一定要使(shi)用耐(nai)受基因指向的(de)、同(tong)一品牌(pai)標號的(de)除草劑(ji)(ji)進(jin)行處理，因為不同(tong)品牌(pai)的(de)除草劑(ji)(ji)成(cheng)份和(he)含量(liang)都不盡相同(tong)，很容(rong)易造成(cheng)選(xuan)擇上的(de)偏差和(he)失誤，如果是雙耐(nai)受基因的(de)特別注意除草劑(ji)(ji)噴施(shi)順序。除草劑(ji)(ji)藥劑(ji)(ji)篩選(xuan)，從(cong)第(di)一回(hui)交(jiao)世代 BC1F1 開始(shi)直到到材(cai)料純(chun)合(he)（如 BC5F3），在每個世代苗期均(jun)需(xu)嚴格執行。

      3）世(shi)代(dai)選擇：對(dui)(dui)于公司優良(liang)品種的(de)(de)親本(ben)進(jin)行(xing)轉育(yu)時，要根據企業條件和(he)成本(ben)預算(suan)，適當增(zeng)加群體量(liang)、多放穗(sui)(sui)行(xing)，回(hui)交(jiao)轉育(yu)過(guo)程中的(de)(de)單株(zhu)性(xing)(xing)狀分(fen)(fen)離，相對(dui)(dui)設置(zhi)比較大的(de)(de)群體，分(fen)(fen)離單株(zhu)表(biao)型表(biao)達更豐富，有(you)更大幾率篩選出最契合目標性(xing)(xing)狀的(de)(de)單株(zhu)，一般一份材(cai)(cai)料(liao)每(mei)個世(shi)代(dai)最少要種 20-30 個穗(sui)(sui)行(xing)、每(mei)穗(sui)(sui)行(xing) 60-100株(zhu)。另外就是(shi)田(tian)間性(xing)(xing)狀的(de)(de)選擇，隨著回(hui)交(jiao)世(shi)代(dai)的(de)(de)增(zeng)加，要選擇接(jie)近(jin)于原材(cai)(cai)料(liao)性(xing)(xing)狀的(de)(de)穗(sui)(sui)行(xing)，尤其到了(le)自交(jiao)純合的(de)(de)各個世(shi)代(dai)，更要注重接(jie)近(jin)原材(cai)(cai)料(liao)的(de)(de)整齊一致(zhi)的(de)(de)優良(liang)穗(sui)(sui)行(xing)。

      通過分子標(biao)(biao)(biao)記(ji)檢測輔(fu)助育(yu)(yu)種家進(jin)行鑒定篩(shai)選(xuan)：對目標(biao)(biao)(biao)基因（或轉基因事件）進(jin)行檢測（PCR/qPCR）根(gen)據每代(dai)的(de)篩(shai)選(xuan)原則（BCnF1 雜合(he)(he)、BCnF2 純合(he)(he)）對后(hou)代(dai)材料的(de)目標(biao)(biao)(biao)基因進(jin)行篩(shai)選(xuan)；并在回(hui)交(jiao)世代(dai)對背景(jing)恢復率進(jin)行檢測篩(shai)選(xuan)（SNP），篩(shai)選(xuan)出后(hou)代(dai)材料中背景(jing)恢復率最高(gao)的(de)材料進(jin)行下一(yi)代(dai)回(hui)交(jiao)，從而加(jia)速選(xuan)育(yu)(yu)周期降低選(xuan)育(yu)(yu)成本。育(yu)(yu)種家在分子標(biao)(biao)(biao)記(ji)檢測結果再進(jin)行單株表型鑒定篩(shai)選(xuan)確定最優轉育(yu)(yu)材料進(jin)行下代(dai)篩(shai)選(xuan)，從而準確更高(gao)效。

      4）組(zu)合測配(pei)(pei)：一般在回(hui)交完(wan)(wan)成(cheng)或自(zi)(zi)交兩代時進(jin)行(xing)，到自(zi)(zi)交工作完(wan)(wan)成(cheng)后，根據配(pei)(pei)合力(li)產量(liang)結果及田(tian)間(jian)農藝性(xing)狀選擇優良穗行(xing)進(jin)行(xing)小面積配(pei)(pei)制，最(zui)終通過品(pin)比鑒定其豐產性(xing)和適應(ying)性(xing)決留 1-2 個(ge)(ge)與原品(pin)種相近的組(zu)合，做 40SSR 的 DNA指紋檢測，是(shi)否與原品(pin)種的差異位點小于 2 個(ge)(ge)。

      5）對最終篩選出(chu)來的材料組(zu)合(he)進行田(tian)間種(zhong)(zhong)植觀測(ce)產量性狀和農藝表型(xing)雙標(biao)選擇！按玉米轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因品(pin)(pin)(pin)(pin)種(zhong)(zhong)審(shen)定試(shi)行標(biao)準要(yao)求，轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因品(pin)(pin)(pin)(pin)種(zhong)(zhong)基(ji)本性狀與受體品(pin)(pin)(pin)(pin)種(zhong)(zhong)無顯著性差異(yi)，試(shi)驗平均產量較受體品(pin)(pin)(pin)(pin)種(zhong)(zhong)增產≥0.0%。同(tong)時回交過程可能(neng)引入不(bu)利(li)基(ji)因和發(fa)生突變，所以一(yi)定需要(yao)育種(zhong)(zhong)家田(tian)間表型(xing)篩選才(cai)能(neng)鎖(suo)定最終的轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因品(pin)(pin)(pin)(pin)種(zhong)(zhong)。最終確定一(yi)個最優組(zu)合(he)參(can)試(shi)報審(shen)。

      感想體會

      在(zai)目前的(de)(de)(de)市場形勢看來，轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)玉米品(pin)(pin)種(zhong)推廣進程推進的(de)(de)(de)沒有預期的(de)(de)(de)反響熱烈，可能是(shi)因(yin)為不同區域(yu)的(de)(de)(de)種(zhong)植(zhi)戶的(de)(de)(de)對轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)玉米品(pin)(pin)種(zhong)需求和認(ren)知不同，以及國家(jia)對糧食安(an)全的(de)(de)(de)把控更為嚴格(ge)。如果在(zai)今(jin)年農業部指(zhi)定的(de)(de)(de) 6 省份中(zhong)指(zhi)定的(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)玉米示范銷售區域(yu)內，轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)玉米品(pin)(pin)種(zhong)的(de)(de)(de)增產(chan)、耕作管理成(cheng)本的(de)(de)(de)減低，種(zhong)植(zhi)戶增收的(de)(de)(de)話，將會(hui)大(da)大(da)有利轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)玉米推廣進程的(de)(de)(de)推進。轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)玉米品(pin)(pin)種(zhong)的(de)(de)(de)推廣或快或慢，但勢在(zai)必行(xing)，國家(jia)已(yi)經(jing)配備了相應的(de)(de)(de)政(zheng)策，所(suo)以要利用有限資源選擇(ze)合適的(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)化(hua)體基(ji)因(yin)，積(ji)極并快速開展自有優良品(pin)(pin)種(zhong)的(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)育工作，不被(bei)生物育種(zhong)時代所(suo)拋棄！