編者按
雜種優勢利用是提高作物產量的有效途徑。雜交種往往比雙親具有更高的產量和更好的抗性。作物雜交種培育依賴于雄性不育系與父本的雜交來生產子代雜交種。因此，作物雄性不育系的培育和維持是雜種優勢利用的重要前提。目前生產上使用的作物雄性不育系主要分為穩定的細胞質不育系和不穩定的細胞核不育系兩類，不僅其創制過程極為復雜，在生產上也存在很多限制。2020年7月8日，Molecular Plant 在線發表了中國農業科學院謝傳曉和李新海研究員領導的研究團隊題為“Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology“的研究論文，報道了基于基因編輯技術發展了新一代作物不育系和雜交種培育的簡易方法。鑒于該研究具有重要的生產應用價值，我們有幸邀請到中科院遺傳所高彩霞研究員與華南農業大學王海洋教授對該論文研究工作分別做了點評與詳細解讀，以饗讀者！
//doi.org/10.1016/j.molp.2020.06.003
專家點評
基因編輯技術助推第三代作物雜交育種技術發展
高彩霞（中國科學院遺傳與發育生物學研究所）
雜交種是作物雜種優勢利用應用到農業生產上的品種類型。雜交種生產上需要雙親（或多親）雜交，避免親本自交成為種子生產環節必須解決的核心問題，雄性不育系應用是解決該問題的重要途徑。因此，作物雄性不育是作物雜種優勢利用的關鍵技術，具有重要的意義與價值。
現代農業發展史上作物雄性不育技術的每一次進步都對農業生產做出了巨大貢獻。以水稻為例，基于細胞質雄性不育系發展而來的第一代“三系法”雜交稻和基于光溫敏感雄性核不育系發展而來的“兩系法”雜交稻均獲得了大面積應用。為克服傳統“三系法”恢、保關系的限制和“兩系法”受光溫等不可控環境因子的影響，隨著分子生物學與現代生物技術的發展，培育基于隱性核不育基因的第三代作物雜交育種技術應運而生。然而，已有的第三代雜交種技術需將隱性核不育突變位點回交導入到不同背景中創制不育系，并需在此基礎之上為不育系提供生物技術元件，以實現不育系與保持系的繁殖和分揀。整個過程耗時長，步驟復雜。當前日新月異發展的新興生物技術，如基因編輯技術為解決這一問題提供了新的技術途徑
中國農業科學院研究人員利用基因編輯實現了一步法創制雄性核不育系并篩選得到配套的保持系，該研究利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯定點刪除了玉米內源MS26基因重要功能域，創制了ms26ΔE5隱性不育系，該編輯活性不影響同時提供的保持系所需的MS26基因的互補表達盒，并實現了保持系生物技術元件半合子遺傳及其與不育系種子的熒光分揀。該技術可以拓展應用于其他雜交種作物中具有產業應用價值的細胞核育性基因種子產業化，為第三代作物雜交種技術提供了高效的解決方案，將助推第三代作物雜交育種技術的發展和產業化應用。該研究是利用基因編輯技術為農作物育種領域傳統途徑無法克服問題提供有效解決方案的又一個案例。
論文解讀
王海洋（華南農業大學）
雄性不育是作物雜種優勢利用的關鍵，根據育性基因的來源分為細胞質雄性不育 (CMS)以及細胞核雄性不育(GMS)兩類[1]。上個世紀70年代，基于CMS發展而來的第一代雜交水稻育種技術成功實現了不育系、保持系與恢復系“三系”配套，并在生產上得到了大規模應用。但是第一代雜交水稻育種技術受制于嚴格的恢、保關系的制約，不僅培育過程復雜，而且資源利用效率低下。
上個世紀90年代，水稻育種家們成功開發出了利用光、溫敏感的細胞核雄性不育系(GMS)和父本雜交生產雜交種的“兩系法，被稱為第二代雜交水稻育種技術。“兩系法”克服了第一代CMS技術對恢復系的限制，也取得了大規模應用。但是“兩系法”因受到光溫等不可控環境因子的影響，生產上存在一定的風險[2]。
近年來隨著現代分子生物學的發展，科學家們提出了利用隱性核不育基因創制穩定的核不育系的設想，即通過把兩個連鎖的育性恢復基因和花粉失活基因通過轉基因手段轉入到一個隱性雄性不育背景中，從而創制一個轉基因雄性保持系。轉基因雄性保持系自交后可以產生一半轉基因雄性保持系種子和一半不含轉基因的不育系種子 [3]。在此基礎上，后人進一步提出了利用一個種子熒光標記基因可以實現不育系和轉基因保持系的分選 [4]。2006年美國杜邦公司率先在玉米上成功開發了該技術，稱之為種子生產技術 （Seed Production Technology, SPT）[5]，隨后我國科學家們很快在水稻和玉米上開發出了類似的技術系統 [6,7,8]。這些技術都需要篩選合適的自然GMS不育系，并將其突變基因通過多代回交導入到其他雜交種生產的母本背景中，并在此基礎上再通過轉基因手段把導入保持系需要的多個生物技術元件，步驟多而繁瑣，進程慢。近日，中國農業科學院科研人員利用基因編輯技術實現了一步法創制核不育系與為該不育系配套的保持系的技術，為第三代作物雜交育種技術提供了高效的技術方案。
2020年7月8日， Molecular Plant在線發表了中國農業科學院題為Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology 的研究論文，報道利用基因編輯技術一步法同時創制作物隱性核不育系（GMS）與操控型核不育性保持系（MGM保持系）的技術體系。在該技術體系中，MGM保持系可同時生產GMS不育系與MGM保持系自身，從而實現了不依賴于自然GMS不育系的作物第三代雜交育種技術。
圖1.MGM保持系創制及其新一代雜交種生產技術原理示意圖
研究人員首先構建與共轉化了MS26ΔE5-Editor和MGM兩個表達載體（圖1A、B），其中，MS26ΔE5-Editor為具有基因編輯活性的CRISPR/Cas9表達載體，轉化的MS26ΔE5-Editor可對玉米內源細胞核基因組編碼的雄花育性基因MS26進行定點編輯，兩個定點DNA斷裂位點分別位于4號內含子與非翻譯區（3’UTR），從而刪除了該基因的第5號外顯子，該外顯子中包括了決定雄花育性功能的細胞色素P450類血紅素結合結構域，從而創制出隱性核基因ms26ΔE5的GMS突變體；共轉化的MGM中包含了MS26育性恢復基因、導致雄配子失活的降解花粉淀粉體的淀粉酶基因、籽粒胚乳糊粉層特異紅色熒光基因3個串聯表達盒。其中，MGM中MS26育性互補表達盒采用MS26 內源自身啟動子與MS26-CDS序列，從而保證了MS26ΔE5-Editor基因刪除定點編輯機制對MGM上攜帶的MS26育性互補表達框編碼序列的沒有編輯活性，兩者兼容。再在被MS26ΔE5-Editor成功編輯得到內源ms26ΔE5目標突變的GMS突變系基礎上，篩選MS26ΔE5-Editor已被成功分離掉，但攜帶MGM載體的陽性植株，在進一步鑒定MGM元件為單拷貝半合子的基礎之上，創制了MGM保持系。
圖2. MGM保持系繁殖的不育系開花期性狀（A）與結實籽粒實現了保持系與不育系種子無損分揀（B，C和D）與世代繁殖
MGM保持系上MS26-CDS表達盒賦予了植株具有孢子體雄花育性完全回復的表型；同時，50%單倍體雄配子體中攜帶MGM元件，MGM元件中的花粉失活表達盒為花粉特異（PG47啟動子）驅動的花粉淀粉體導肽定向的alpha淀粉酶（ZmAA1），該酶水解了雄配子細胞(花粉)中淀粉體中的淀粉，從而耗竭了這部分雄配子體能量供應，致使這50%雄配子體徹底失活并失去育性，該活性使MGM元件僅能通過雌配子體向后代遺傳，形成MGM遺傳元件半合子（hemizygous）孢子體。因此，MGM保持系只可產生一半可育的花粉，該花粉不攜帶MGM元件（圖2A）；此外，MGM還攜有一個籽粒糊粉層細胞（Aleurone cell）特異表達的紅色熒光蛋白標簽(DsRED)，致使保持系中通過雌配子產生的攜帶MGM的半合子種子帶有紅色熒光。因此，這個MGM保持系孢子體植株自交結實籽粒會產生一半的攜帶MGM元件的半合子保持系，這部分種子顯紅色熒光；另一半種子不攜帶MGM元件，為GMS不育系種子（圖2B），保持系自交產生的種子可分揀為帶紅色熒光的MGM保持系種子與無熒光的GMS不育系種子。研究還表明這種種子分揀信號可被肉眼與熒光分揀機器識別(圖2 C，D)，從而實現保持系與不育系種子的無損傷分揀；分揀得到的GMS不育系可用于雜交種制種生產，MGM保持系種子用于下一個生產年份的保持系和不育系的繁殖，如此反復，形成高效的第三代雜交種制種生產技術。
綜上所述，該技術大大提高了培育第三代作物雜交種的研發效率，可以高效地把目標雜交種的母本轉變成MGM保持系，然后應用于雜交種制種與親本繁殖。同樣的技術策略可以延伸用于其他細胞核育性基因和其他作物的雜交種生產。通過該技術體系生產的不育系和雜交種將不含有轉基因，是利用基因編輯技術快速進行農作物雜交育種的一個簡單、有效途徑。
參考文獻：
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